En bref
Des chercheurs ont réussi à observer des cellules vivantes à grande profondeur dans le cerveau de souris, sans enlever les couches de tissu qui les recouvrent. Leur nouvelle méthode recueille beaucoup plus de lumière que les techniques précédentes et permet de suivre l’activité de cellules jusqu’à environ 2 millimètres de profondeur. Elle ouvre de nouvelles possibilités, mais ne permet pas de voir toutes les régions du cerveau.
Dans un cerveau vivant, la lumière pénètre difficilement jusqu’aux régions profondes : les tissus la dispersent, et les signaux des cellules observées se mêlent à une lumière de fond qui brouille l’image. Pour mieux voir la zone visée, des chercheurs ont parfois dû retirer le tissu qui la recouvre. Une plateforme mise au point par une équipe de l’université Rockefeller offre une autre possibilité : observer plus profondément l’activité des cellules nerveuses chez la souris, sans enlever le cortex situé au-dessus.
La profondeur n’est pas le seul obstacle
Les chercheurs devaient résoudre deux problèmes à la fois. Plus la lumière s’enfonce dans le cerveau, plus elle se disperse, et plus il devient difficile de déterminer d’où vient le signal fluorescent. Mais envoyer une lumière plus intense ne suffit pas à corriger le problème : augmenter la puissance moyenne du laser risque de réchauffer les tissus et de les endommager. Il faut donc obtenir un signal exploitable sans dépasser les limites d’exposition au laser considérées comme sûres.
Les microscopes à fluorescence utilisent des molécules qui émettent de la lumière lorsqu’elles sont activées. Dans le cerveau, ces signaux permettent notamment de suivre l’activité des cellules et les variations du calcium à l’intérieur des neurones. Toutefois, la lumière dispersée peut créer un halo de fond qui masque le signal recherché. Et plus les cellules sont éloignées de la surface du cerveau, plus il est difficile de distinguer l’activité de chacune.
L’imagerie à trois photons présente un avantage potentiel : elle produit moins de fluorescence de fond que l’imagerie à deux photons et pourrait donc, en principe, permettre d’observer des tissus plus profonds. Pour en tirer parti, il faut néanmoins des impulsions laser suffisamment puissantes pour produire un signal mesurable. Les chercheurs doivent ainsi trouver un équilibre entre une vision plus profonde et la préservation des tissus. Augmenter simplement l’énergie du laser ou modifier un seul élément ne permet pas de résoudre cette difficulté.
Repenser l’ensemble du système d’imagerie
Au lieu de considérer le microscope comme un appareil aux réglages figés, l’équipe d’Alipasha Vaziri, qui dirige le laboratoire de neurotechnologie et de biophysique de l’université Rockefeller, a revu la manière dont ses différents éléments sont coordonnés. Les chercheurs ont appelé leur plateforme TrUDI, pour imagerie à trois photons à très grande profondeur. Les résultats, publiés dans la revue Nature Methods, décrivent l’enregistrement de l’activité de groupes de neurones avec une résolution cellulaire, à une profondeur d’environ 2 millimètres.
L’équipe s’est appuyée sur des modèles informatiques pour guider les modifications apportées au laser, aux composants optiques et au dispositif de détection des signaux. L’objectif n’était pas seulement d’atteindre la plus grande profondeur possible : il fallait aussi trouver un équilibre entre les caractéristiques des impulsions lumineuses, la propagation et la collecte de la lumière, la vitesse de l’imagerie et la surface observée. La conception devait également respecter les limites d’exposition au laser considérées comme sûres, tout en permettant de mesurer les variations du calcium avec assez de précision pour distinguer des cellules individuelles.
Le principe essentiel est que les performances ne dépendent pas d’une seule pièce de l’appareil. Le laser doit être adapté au système optique, tandis que la méthode de balayage et d’enregistrement doit tenir compte de la vitesse à laquelle les signaux nerveux évoluent. Si ces éléments ne sont pas coordonnés, une partie des photons utiles peut être perdue ou la lumière indésirable augmenter, même si chaque composant fonctionne bien séparément. L’équipe a donc optimisé l’ensemble du système plutôt que de se contenter de modifier un réglage habituel.
Un signal plus fort sans augmenter la puissance du laser
Le principal résultat chiffré de l’étude est que TrUDI a permis de détecter environ 250 fois plus de photons de fluorescence qu’avec les méthodes précédentes, à puissance de laser égale. Cette comparaison est importante : recueillir davantage de photons fournit plus d’informations sur le signal, sans qu’il soit nécessaire d’augmenter simplement la puissance moyenne du laser, au risque de chauffer les tissus ou de les abîmer.
Ce résultat ne signifie pas que tous les signaux sont devenus plus forts dans la même proportion, quelle que soit la région observée, ni que toutes les parties du cerveau sont désormais visibles. Il indique que les améliorations coordonnées ont permis de recueillir davantage de lumière fluorescente dans les conditions propres à la plateforme. Les chercheurs peuvent ainsi distinguer l’activité de cellules individuelles à une profondeur auparavant difficile à atteindre. La qualité des observations dépend toujours de la zone étudiée, des propriétés optiques des tissus et des limites de sécurité.
Les chercheurs ont également ajouté une méthode qui stimule les cellules visées au lieu d’éclairer en continu tout le champ d’observation. Le laser est activé lorsque le balayage passe sur des cellules préalablement repérées, mais n’est pas utilisé de la même manière en dehors de ces zones. En concentrant ainsi l’éclairage sur les cellules recherchées, l’équipe peut mieux cibler l’exposition à la lumière. Cette approche fait partie des améliorations conçues pour renforcer le signal tout en tenant compte de la quantité de lumière qui atteint les tissus.
D’une limite de 1,2 millimètre à près de 2 millimètres
Avant cette étude, les enregistrements fonctionnels réalisés par imagerie à trois photons atteignaient environ 1,2 millimètre de profondeur. Cette distance restait inférieure à la profondeur théorique que la technique pourrait atteindre, au-delà de 2 millimètres. Les résultats obtenus avec TrUDI montrent qu’en coordonnant le laser, les composants optiques et l’enregistrement, il est possible de se rapprocher de cette profondeur théorique, plutôt que de considérer les performances antérieures comme une limite infranchissable.
L’équipe a testé la plateforme chez des souris et enregistré l’activité de groupes de neurones dans le cortex cérébral et l’hippocampe, à une profondeur proche de 2 millimètres. Le champ de vision atteignait environ 230 × 230 micromètres, et la fréquence d’enregistrement était de 8,6 hertz. Ces mesures permettent de préciser la portée de l’avancée : il ne s’agit pas seulement de produire une image fixe d’une structure profonde, mais de suivre une activité nerveuse changeante dans une zone donnée, à une cadence déterminée.
Ces détails sont importants pour comprendre ce que l’appareil permet réellement. Un champ de vision de 230 × 230 micromètres ne couvre qu’une petite portion de tissu, tandis qu’une fréquence de 8,6 hertz définit le rythme auquel les données sont recueillies. Il ne faut donc pas imaginer que la technique montre tout le cerveau en une seule fois ou enregistre sans limite chaque événement nerveux. C’est un outil permettant d’étudier des groupes de cellules situés en profondeur, avec des contraintes spatiales et temporelles à prendre en compte lors de la conception des expériences.
Pourquoi préserver le cortex ?
Lorsqu’il faut retirer le tissu qui recouvre une région profonde pour l’étudier, le contexte anatomique de la zone ciblée se trouve modifié. Il peut alors être plus difficile de comparer les observations avec celles d’un cerveau qui n’a pas subi d’intervention. En observant la région à travers les couches qui la recouvrent, les chercheurs disposent d’un moyen de suivre certaines structures profondes tout en laissant le cortex intact. Cela ne supprime pas toutes les conséquences des manipulations expérimentales, mais permet, lorsque la lumière peut atteindre la cible, d’étudier l’activité sans retirer le tissu sus-jacent.
Cette possibilité pourrait aider à comprendre comment des groupes de neurones coordonnent leur activité dans des régions profondes du cerveau. Plutôt que de limiter les observations à la surface, les chercheurs peuvent suivre des cellules du cortex et de l’hippocampe à plus grande profondeur, puis examiner les variations simultanées de leur activité dans les limites du champ observé. Il s’agit toutefois d’un progrès dans les outils de mesure : la plateforme n’explique pas à elle seule le rôle des circuits nerveux, mais elle pourrait fournir des données utiles pour poser des questions plus précises et concevoir de meilleures expériences.
Atteindre une certaine profondeur ne signifie pas que toutes les structures situées à cette profondeur deviennent accessibles. La forme et la position de la région, ainsi que les propriétés des tissus qui l’entourent, influencent la possibilité de l’observer. Alipasha Vaziri a précisé que certaines parties du striatum restent hors de portée de cette méthode et que plusieurs noyaux plus profondément situés nécessitent des approches invasives. Une profondeur proche de 2 millimètres ne garantit donc pas que l’appareil puisse observer n’importe quelle cible choisie par les chercheurs.
Ce que l’étude établit — et ce qui reste à explorer
Les résultats montrent qu’il est possible d’améliorer l’imagerie en profondeur en réajustant les différents éléments du système, plutôt qu’en augmentant simplement la puissance du laser. Avec TrUDI, les chercheurs ont accordé les caractéristiques de l’excitation lumineuse aux capacités du système optique et à la méthode de collecte des données, tout en tenant compte de la qualité du signal et des contraintes thermiques, temporelles et spatiales. Cette approche a permis de recueillir davantage de fluorescence et d’enregistrer l’activité de cellules à une profondeur proche de 2 millimètres dans le cerveau de souris vivantes.
Ces résultats ne signifient pas que la technique peut remplacer toutes les méthodes d’imagerie du cerveau, ni qu’elle rend les interventions chirurgicales inutiles dans toutes les expériences. Certaines cibles profondes restent trop éloignées, certaines zones du striatum ne sont pas accessibles, et l’imagerie se limite à un champ de vision et à une fréquence d’enregistrement définis. L’intérêt de la plateforme est donc d’étendre la zone que l’on peut observer par voie optique tout en préservant le cortex au-dessus des régions étudiées, et non de faire disparaître toutes les limites techniques.
La suite des travaux dépendra des questions précises auxquelles les chercheurs voudront répondre et de la pertinence de l’outil pour d’autres régions et d’autres expériences. À ce stade, l’étude montre qu’il est possible de se rapprocher de la limite théorique de l’imagerie à trois photons grâce à des améliorations réfléchies et coordonnées, testées chez la souris. Les chiffres obtenus ne permettent pas, à eux seuls, de déterminer si cette approche conviendra à des cibles encore plus profondes ou à d’autres configurations.
Conclusion
L’équipe du laboratoire de neurotechnologie et de biophysique de l’université Rockefeller a mis au point TrUDI pour observer en profondeur l’activité des neurones dans le cerveau de souris, sans retirer le cortex qui recouvre la région ciblée. En coordonnant le laser, les composants optiques et l’enregistrement, les chercheurs ont détecté environ 250 fois plus de photons de fluorescence à puissance de laser égale et suivi l’activité de cellules à une profondeur proche de 2 millimètres, contre environ 1,2 millimètre avec les enregistrements précédents. Les essais ont porté sur le cortex et l’hippocampe, dans un champ de 230 × 230 micromètres et à une fréquence de 8,6 hertz. Cette avancée élargit les outils disponibles pour étudier le cerveau, mais ne permet pas d’observer toutes ses régions profondes et ne rend pas les méthodes invasives inutiles dans certains cas.